Всё для Учёбы — студенческий файлообменник
1 монета
odt

Студенческий документ № 009274 из РГТЭУ (РИ)

Приготовление препаратов микроорганизмов и их исследование под микроскопом.

Для микроскопирования пробы готовится препарат. Для этого капля пробы помещается на предметное стекло и накрывается покровным. Предметное стекло представляет собой стеклянную пластинку размером 76х26 мм и толщиной не более 1.1 мм. Покровные стекла тонкие (толщина 0,15-0,17 мм), квадратные и небольших размеров (18х18 или 24х24 мм). Новые предметные и покровные стекла кипятят в мыльной дистиллированной воде 10-20 минут, затем промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой, сушат или протирают полотняной тканью. Предметные и покровные стекла хранят сухими в закрытой посуде или в 95%-ном спирте.

Перед приготовлением препаратов микробиологический стол протирают от пыли ватным тампоном, смоченным спиртом. Руки моют и также протирают спиртом. Предметные и покровные стекла достают из спирта пинцетом, протирают чистой мягкой тканью или фильтровальной бумагой и досушивают в пламени спиртовки.

Препараты живых микроорганизмов.

Для определения формы микроорганизмов, их подвижности, физиологического состояния готовят препараты живых микроорганизмов и ведут прижизненное наблюдение.

Приготовление препарата для наблюдения в раздавленной капле. На чистое предметное стекло стерильной петлей помещают каплю исследуемой жидкости и накрывают покровным стеклом. При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться ребром его к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить. Иногда под стеклом остаются пузырьки воздуха. Если пузырьки воздуха единичные, то они не мешают микроскопированию и ими можно воспользоваться при отыскании мелких микроорганизмов в поле зрения микроскопа. Если пузырьков воздуха много, то препарат следует переделать. Капля должна быть небольшой, чтобы жидкость не выступала за края покровного стекла. Излишек жидкости, вышедшей из-под покровного стекла, удаляют полосками фильтровальной бумаги.

Если рассматривают культуру, выросшую на плотной питательной среде, то на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и в нее вводят иглой небольшое количество исследуемой культуры. Приготовленный препарат рассматривают под микроскопом.

Приготовление препарата для наблюдения в висячей капле. Для этого используют предметное стекло со специальным углублением, с луночкой. Висячей каплей удобнее пользоваться для наблюдения-подвижности микроорганизмов, размножения, прорастания спор. Препарат готовят так: в центр покровного стекла помещают небольшую каплю жидкости с микроорганизмами, покровное стекло с каплей культуры накрывают предметным стеклом с лункой, предварительно смазав ее края тонким слоем вазелина, предметное стекло осторожно прижимают к покровному и быстро перевертывают препарат.

Изучение клеточных структур. Микроорганизмы можно наблюдать в неокрашенном виде и с прижизненной окраской. Для этого используют малоконцентрированные растворы различных красок, которые не оказывают на микроорганизмы губительного действия, дифференцированно окрашивают содержимое клетки и способствуют более точному изучению формы клеточных структур. Для прижизненной окраски дрожжей и бактерий применяют нейтральную красную, метиленовую синюю, нейтральную фиолетовую, зеленый янус, эозин и эритрозин в очень незначительных концентрациях- от 0,001 до 0,0001%. Окрашенный препарат готовят введением под покровное стекло небольшой капли раствора красителя или микроорганизмы вносят в каплю краски на предметном стекле, после чего каплю накрывают покровным стеклом.

Препараты убитых микроорганизмов.

Такими препаратами пользуются в тех случаях, когда необходимо рассмотреть детали строения клеток (ядро, включения, споры), произвести подсчет микроорганизмов и т. д. Для этого микроорганизмы фиксируют на предметном стекле и окрашивают. Приготовление препарата состоит из ряда операций.

Каплю с микроорганизмами петлей распределяют возможно более тонким слоем на обезжиренном предметном стекле площадью около 4 см2. Можно приготовить мазок, пользуясь стеклом со шлифованным краем, которое для распределения капли передвигают вдоль предметного стекла. Затем препарат высуши-вают при комнатной температуре. Для ускорения высушивания препарат мазком вверх осторожно прогревают над пламенем горелки.

Следующая важная операция - фиксация, целью которой является убить микроорганизмы и закрепить их на стекле. Существует много способов фиксации. Простейшим из них является фиксация пламенем. Для этого препарат медленно 3-4 раза проводят над верхней частью пламени горелки таким образом, чтобы сильно нагреть нижнюю поверхность стекла, чем и достигается фиксация. Для фиксации микроорганизмов также широко применяют растворы различных химических веществ: этиловый спирт (96% об.) в течение 5-20 мин; смесь равных объемов этилового спирта и эфира -5 мин; метиловый спирт - 5 мин; смесь формалина (5 мл) со спиртом (95 мл) - 2 мин и др.

На фиксированный препарат наносят раствор какого-либо красителя в зависимости от цели исследования.

Прямое флуорохромирование - это непосредственная окраска живых или фиксированных микроорганизмов флуоресцирующими красителями, такими, как берберин-сульфат, акридин оранжевый, аурофосфин, нейтральная красная, примулин и др. Они объединяются по двум признакам: по способности ярко люминесцировать в сине-фиолетовых или ультрафиолетовых лучах и по избирательному связыванию с определенными тканевыми или клеточными элементами. При окраске для наблюдений за формой микроорганизмов применяют водно-спиртовые растворы метиленовой синей или метиленовой фиолетовой (насыщенный спиртовой раствор, разведенный в 5-10 раз водой). Окрашивание длится 3-5 мин. после чего краску сливают, препарат промывают легкой струей дистиллированной или водопроводной воды и высушивают. На сухой мазок наносят каплю воды, накрывают стеклом и микроскопируют. Если для исследования пользуются иммерсионной системой, то иммерсионное масло наносят непосредственно на сухой мазок.

Окраска по Граму - это важный диагностический признак. Метод основан на том, что протоплазма одних видов микроорганизмов образует прочное, нерастворимое в спирте соединение йода с красителем; у других видов это соединение не образуется. Для окраски препарат фиксируют и обрабатывают карболовым раствором генцианового фиолетового, затем раствором Люголя. Из микроорганизмов, развивающихся в сусле и в вине, красятся по Граму (грамположительные), имеют сине-фиолетовый цвет - дрожжи, молочнокислые бактерии (стрептококки и палочки); не красятся по Граму (грамотрицательные), имеют красный цвет - уксуснокислые бактерии.

Окраска клеточных включений. Каплю исследуемой жидкости смешивают на предметном стекле с каплей, водного раствора красителя, накрывают покровным стеклом и через 5 мин микроскопируют. При прижизненной окраске волютин чаще всего образует зерна в вакуолях. При окраске нейтральной красной и метиленовой синей (растворы 1: 5000) волютин в вакуолях клеток дрожжей выпадает в виде ярко окрашенных красных или синих шариков. При окраске фиксированного препарата метиленовым синим волютиновые зерна приобретают фиолетовый или фиолетово-красный цвет, а цитоплазма клетки окрашивается в голубой. Хорошо окрашиваются также включения молочнокислых бактерий- палочек. Для наблюдений живых микроорганизмов готовят 0,01%-ные и 0,001 %-ные водные растворы красок. Для этого 10 мг сухой краски растворяют в 1 л дистиллированной воды. Для окраски фиксированных препаратов готовят растворы в соотношении 1 :40 (1 мл насыщенного спиртового раствора краски смешивают с 40 мл воды). Гликоген почти всегда содержится в клетках микроорганизмов в виде включений или в растворенном состоянии в цитоплазме. Характерной для него является окраска йодом в красно-бурый цвет.

Для обнаружения гликогена на фиксированных препаратах используют крепкий раствор йода (7 г йода+ 20 г йодистого калия + 100 мл дистиллированной воды). Препарат рекомендуется предварительно обезжирить, можно при фиксировании в смеси спирта с эфиром 1 : 2. Для прижизненного окрашивания микроорганизмов, используют раствор Люголя (0,33 г йода кристаллического+ 0,66 г йодистого калия+100 мл воды дистиллированной). Сначала в 10 мл воды растворяют йодистый калий, затем - йод и доливают водой до 100 мл. Жир в клетках микроорганизмов чаще всего встречается в виде липопротеидных телец.

Для окраски жира используют раствор 0,1 г судана (судан III) в 20 мл 95%-ного спирта или в концентрированной молочной кислоте. К капле густой суспензии микроорганизмов на предметном стекле добавляют каплю 40%-ного формалина и оставляют на 5 мин. К фиксированному таким образом препарату прибавляют каплю раствора метиленовой синей (1 :40) и оставляют на 10 мин. Затем добавляют каплю свежеприготовленной смеси равных объемов спиртового раствора Судана и воды. Плазма окрашивается в синий цвет, капли жира в розовый, а вакуоли остаются бесцветными. Сера может быть, в клетках в виде полужидких маслянистых капель, сильно преломляющих свет.

Чтобы убедиться, что клетки дрожжей содержат "элементарную серу", их следует высушить, затем растворить капли серы в сероуглероде или безводном спирте, или в растворе гидроксида калия и соды (в последней при нагревании). Обработав препарат высокой температурой, затем в течение 1 мин концентрированной пикриновой кислотой, после промывания водой можно наблюдать кристаллизацию серы в виде одноклиномерных кристаллов, чаще расположенных вне клеток. При наличии большой массы дрожжей ее высушивают, помещают в сероуглерод, а затем профильтровывают настой, дают ему испариться на часовом стекле. Полученный желтый маслянистый остаток при сжигании превращается в сернистый ангидрид, легко обнаруживаемый по характерному запаху.

Показать полностью…
29 Кб, 22 декабря 2011 в 17:51 - Россия, Ростов-на-Дону, РГТЭУ (РИ), 2011 г., odt
Рекомендуемые документы в приложении